Raziskovalci Nacionalnega inštituta za biologijo sodelovali pri razvoju procesov za proizvodnjo najdražjega zdravila na svetu

Sodobna zdravila za gensko terapijo omogočajo popravljanje napak v človekovih genih ter s tem zdravljenje genskih bolezni. Za razliko od klasičnih zdravil ne vsebujejo kemijskih spojin, ampak viruse, ki služijo kot dostavna vozila za nadomestne zdrave gene.

Eden glavnih izzivov pri razvoju zdravil za gensko terapijo z virusnimi prenašalci je vzpostavitev procesa za njihovo industrijsko proizvodnjo. To zahteva optimizacijo postopkov gojenja virusov v celicah, njihovega čiščenja, analitskih metod, ki omogočajo sledenje kvalitete proizvodnega procesa, kot tudi natančno karakterizacijo virusa.

Nacionalni inštitut za biologijo (NIB) je pionir na področju metod za določanje in kvantifikacijo gensko spremenjenih organizmov in mikroorganizmov, vključno z virusi. S prvim sistemom za kapljično digitalno verižno reakcijo s polimerazo (ddPCR) v Evropi, ostalo razpoložljivo opremo za molekularno biologijo in elektronsko mikroskopijo ter z dolgoletnimi izkušnjami pri delu z virusi, so svetovno prepoznani na področju kvantifikacije nukleinskih kislin in virologije.

Pridobljene izkušnje sedaj prenašajo na druga področja, vključno z gensko terapijo. Za raziskavo objavljeno v odlični reviji iz področja mikrobiologije, Frontiers in Microbiology, so se povezali s podjetjem BIA Separations, ki je vodilno na področju koncentracije in čiščenja virusov z naprednimi filtri, ter z Weill Medical College Univerze Cornell iz ZDA, ki je pripravila vzorce gensko spremenjenih z adenovirusi povezanih virusov (AAV).

Za uporabo v genski terapiji so virusi AAV pomembni, ker lahko njihovi različni sevi dostavijo pakete v različna tkiva telesa. Z izborom posameznega seva lahko dostavimo zdravilo v točno določeno izbrano tkivo. Virus AAV v humane celice zelo učinkovito prenese zdrave gene, kjer nadomestijo nedelujoče gene, ki povzročajo bolezen.

Molekularne analitske metode, kot je na primer verižna reakcija s polimerazo v realnem času (qPCR), nam omogočajo natančno določitev števila virusov v vzorcu. V zadnjem času je vse več pozornosti namenjeno novemu, najnatančnejšem pristopu imenovanemu digitalna verižna reakcija s polimerazo (dPCR), s katerim lahko natančno preštejemo viruse, tudi če nimamo dobro znanega referenčnega materiala.

Na podlagi rezultatov analitskih metod lahko med razvojem proizvodnega postopka spremljamo, kako spremembe vplivajo na izkoristek, čistost in infektivnost virusa. Med samim procesom proizvodnje so v vmesnih stopnjah na poti do končnega zdravila prisotne številne nečistoče, ki so nezaželene, poleg tega pa lahko motijo analitske metode. Izbor analitskih metod je zato ključnega pomena, saj lahko z izborom prave metode povečamo zanesljivost meritve.

V študiji karakterizacije AAV virusnih prenašalcev so avtorji združili dva pristopa: molekularno biologijo in elektronsko mikroskopijo. Pokazali so, da štetje virusov z novo metodo ddPCR, v smislu robustnosti in variabilnosti, deluje bolje kot standardna metoda qPCR. To je še posebej pomembno za analize delno očiščenih vzorcev med samim razvojem in optimizacijo procesov. Na praktičnem primeru so pokazali na nujnost uporabe transmisijske elektronske mikroskopije kot dopolnilne metode molekularnim metodam za opazovanje integritete virusnih delcev, agregacije in prisotnih nečistoč. Poleg tega so pokazali, da je pomembna priprava vzorcev pred samo analizo s PCR.

"Ugotovili smo, da je karakterizacija terapevtskih virusov veliko bolj informativna, kadar se za njihovo karakterizacijo uporablja kombinacija molekularnih pristopov in elektronske mikroskopije, v zadnjem času pa vse več uporabljamo tudi visokopretočeno sekvenciranje (HTS). NIB na ta način pomaga pri razvoju postopkov proizvodnje in čiščenja različnih virusov več mednarodnim biofarmacevtskim podjetjem" je povedala prof. dr. Maja Ravnikar, vodja Oddelka za biotehnologijo in sistemsko biologijo.

Vrhunsko znanje Nacionalnega inštituta za biologijo na tem področju je prepoznalo tudi podjetje AveXis iz skupine Novartis, ki mu je ameriška Agencija za hrano in zdravila (FDA) pred kratkim za zdravljenje dojenčkov s spinalno mišično atrofijo (SMA), starih manj kot dve leti, odobrila gensko zdravilo Zolgensma®. SMA je huda živčno-mišična bolezen, za katero je značilna izguba motoričnih nevronov, kar vodi do progresivne mišične šibkosti in paralize. Posamezna terapija z novim genskim zdravilom stane 2,1 milijona dolarjev, zato velja za trenutno najdražje zdravilo na svetu.

Nacionalni inštitut za biologijo je sodeloval pri razvoju AveXis-ovega zdravila na osnovi terapevtskih virusov s specifičnimi analitskimi tehnikami, ki so potrebne za natančno karakterizacijo zdravila, kot so digitalna verižna reakcija s polimerazo, elektronska mikroskopija in visokopretočno sekveniranje, vključno s prenosom tehnologij v njihove nove obrate v ZDA. Pri razvoju procesa čiščenja zdravila oziroma virusa AVV s pametnimi filtri je sodelovalo tudi slovensko podjetje BIA Separations, s katerim Nacionalni inštitut za biologijo sodeluje od njegove ustanovitve.

"NIB je počaščen, da lahko pomaga pri razvoju visokotehnoloških zdravil," je dejal izr. prof. dr. Matjaž Kuntner, direktor NIB ob odobritvi zdravila. "Ponosni smo, da prispevamo svojo ekspertizo in izkušnje, ki omogočajo natančno karakterizacijo zdravila, kar ima velik vpliv na skupnost bolnikov s spinalno mišično atrofijo."

Dr. Miomir Knežević, direktor podjetja za celično biologijo Educell d.o.o. pravi, da je "število in kakovost rekombinantnih virusov ključen del varne in učinkovite genske terapije, ki zagotavlja ustrezen terapevstki učinek." Doda še: "NIB je izjemno zanesljiv partner, ki so ga prepoznali tudi tuji partnerji in veseli nas, da kontrola kakovosti terapevtskih produktov v veliki meri temelji na NIB-ovem ekspertnem znanju. Prav tako nas veseli, da kljub slabi podpori sodelovanju visokotehnoloških podjetij in akademskih institucij v slovenskem prostoru, do tega vseeno prihaja."

"Število terapevtskih virusov v dozi zdravila mora biti natančno določeno preden se injicira v bolnika. Z možnostjo neposrednega štetja izbranih tarč ima tehnologija kapljične digitalne PCR pomembno vlogo na področju genske terapije" o prihodnosti nove tehnologije zaključi dr. David Dobnik, prvi avtor študije.

Referenca: Dobnik D, Kogovšek P, Jakomin T, Košir N, Tušek Žnidarič M, Leskovec M, Kaminsky SM, Mostrom J, Lee H and Ravnikar M (2019) Accurate Quantification and Characterization of Adeno-Associated Viral Vectors. Front. Microbiol. 10:1570. doi: 10.3389/fmicb.2019.01570

Povezava na objavo: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2019.01570/full